官方网站-首页

【导语】近日，上海师范大学生命科学学院芦银华研究员团队在《中国科学：生命科学》英文版上发表了重要研究成果。该研究首次在非模式工业放线菌——刺糖多孢菌中，成功建立了基于内源I-B型CRISPR/Cas系统的高效基因组编辑工具。这一突破不仅解决了刺糖多孢菌长期面临的遗传操作难题，还为其他难以改造的工业微生物提供了新的编辑思路。刺糖多孢菌是生产环境友好型杀虫剂多杀菌素的关键菌株，该研究成果有望推动其高产育种进程，提升生物农药的生产效率。

近日，上海师范大学生命科学学院芦银华研究员团队在《中国科学：生命科学》英文版发表重要研究成果，首次在非模式(shì)工(gōng)业(yè)放(fàng)线(xiàn)菌(jūn)中(zhōng)建(jiàn)立(lì)了(le)一(yī)种(zhǒng)基(jī)于(yú)内(nèi)源(yuán)I-B型(xíng)CRISPR/Cas系(xì)统(tǒng)的(de)高(gāo)效(xiào)基(jī)因(yīn)组(zǔ)编(biān)辑(ji)工(gōng)具(jù)，解(jiě)决(jué)了(le)工(gōng)业(yè)放(fàng)线(xiàn)菌(jūn)刺(cì)糖(táng)多(duō)孢(bāo)菌(jūn)（Saccharopolyspora spinosa）长(zhǎng)期(qī)面(miàn)临(lín)的(de)遗(yí)传(chuán)操(cāo)作(zuò)难(nán)题(tí)，也为其他难以改造的工业微生物提供了新思路。

刺糖多孢菌是生产绿色生物农药多杀菌素的重要工业菌株。多杀菌素具有高效、广谱的杀虫活性，且哺乳动物细胞毒性低、安全性高，是一种“环境友好型”杀虫剂。然而，刺糖多孢菌转化效率低、遗传工具匮乏，导致其代谢工程改造困难重重，产能瓶颈难以解决。依赖外源CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术虽然已在诸多物种取得突破，但针对工业微生物，依然面临转化效率低、宿主毒性强等问题，难以广泛应用。研究团队另辟蹊径，巧用细(xì)菌(jūn)“原(yuán)生(shēng)剪(jiǎn)刀(dāo)”——内(nèi)源(yuán)I-B型CRISPR/Cas系统，通过生物信息学分析和实验验证，确定了该系统识别的PAM序列（基因切割的“定位信号”）（图1）。通过重编程靶向自身基因组的微型CRISPR阵列，建立新型编辑工具，成功实现高效的基因敲除。该方法无需导入外源Cas蛋白，编辑质粒更小、毒性更低。

图1. 刺糖多孢菌内源Type I-B型CRISPR/Cas系统。

（A）刺糖多孢菌内源CRISPR/Cas系统组成及转录分析。（B）I-B型CRISPR/Cas系统组成的Cascade复合体在crRNA引导下靶向DNA示意图。Cascade复合体由Cas11、Cas8、Cas7、Cas6、Cas5等蛋白组成。在PAM被Cas8识别后，Cascade结合到目标DNA上，招募Cas3在原间隔区内切割目标DNA的非靶向链。（C）WebLogo显示的介导CRISRP/Cas系统DNA切割功能的可能PAM序列。

另外，刺糖多孢菌具有多种RM防御系统，如同“分子守卫”般切割外来DNA，导致质粒转化效率极低。研究团队利用新开发的基因敲除工具，逐一敲除(chú)关键RM系统，得到一株转化效率显著提高的工程菌株，这为后续的遗传操作扫清了障碍。在此基础上，实现了荧光报告基因mCherry的高效插入，以及长达75 kb的多杀菌素生物合成基因簇的成功敲除（图2）。这些结果显示该工具针对单基因以及基因簇强大的编辑能力，为刺糖多孢菌高产育种提供了必要的技术支撑。

图2. 基于内源CRISPR系统的高效基因组编辑技术应用于外源基因插入及刺糖多孢菌基(jī)因(yīn)簇(cù)大(dà)片(piàn)段(duàn)敲(qiāo)除(chú)。

（A）构(gòu)建(jiàn)敲(qiāo)除(chú)质(zhì)粒(lì)，实(shí)现(xiàn)对(duì)目(mù)标(biāo)基(jī)因(yīn)簇(cù)敲除示意图。（B）基因簇敲除菌落PCR鉴定，上图为基因簇外侧引物PCR验证，下图为利用基因簇内部引物PCR验证。（C）基因簇敲除菌株的Sanger测序验证。（D）mCherry插入刺糖多孢菌基因组示意图。mCherry插入菌落PCR鉴定（E）及测序验证（F）。